克隆性确证

自1986年美国食品药品监督管理局批准第一种重组以来，多年来批准的生物制药数量不断增长，反映出它们与现代医学的关系越来越紧密。到2021，FDA批准了第100个单克隆抗体产品以及其他9种新的生物药物，占当年批准药物总数的16%。生物制药市场35年的稳定增长模式反映了这些药物是治疗多种疾病最有效的临床治疗方式之一；因此，它们越来越多地被用于几乎所有的医学分支。

生物治疗是针对人体中特定分子的尖端药物，用于治疗广泛传播的疾病如癌症、免疫疾病和代谢紊乱等。哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和人类胚胎肾293（HEK 293）细胞，是用于制造重组DNA（rDNA）来源的人类治疗蛋白的最常见平台。这些细胞系经过改造，携带编码所需蛋白质的基因，是生物技术公司可以拥有的最重要的资产。因此，公司需要确保这些细胞系或细胞产物的安全性、纯度和有效性，并控制生产过程中的可变性，以确保最终产品的一致性。

单克隆性：向监管申报的关键

具有很好表征的单克隆来源的细胞系不仅是生物制药生产过程的基本组成部分，也是监管申报的要求，最常见的是在研究新药（IND）申请阶段。实际上克隆衍生确实会影响产品的关键质量属性。因此，确保生产细胞系中的克隆性是至关重要的，并且应该在细胞系开发过程中尽早确认。事实上，作为总体控制策略的一部分，监管机构要求所有生物制造细胞系都是“从单个细胞祖细胞中克隆出来的”，以确保产品质量的安全性和一致性。美国（FDA）和欧盟（EMA）在生产细胞系的克隆衍生方面，对生物治疗药物的生产有不同但重叠的指导方针。

亚克隆的经典方法：有限稀释和流式细胞术（FACS）

为了产生克隆衍生的细胞系，需要分离、培养和扩增单个前体细胞。进行这种亚克隆步骤的传统方法是有限稀释（LD），它是在20世纪80年代初开发的，用于在单克隆抗体的生产中克隆杂交瘤细胞系。尽管LD是一种相对便宜的工艺，但劳动密集、耗时且产量低；科学家之间的差异也很大，不允许使用手动显微镜进行记录。此外，潜在的统计考虑是基于用珠子而不是细胞进行的研究，没有考虑到细胞的行为不像珠子，因为它们往往粘在一起。因此，即使进行两轮克隆，也可能无法完全保证基因的同质性。

流式细胞术（FACS）最初是作为一种研究工具开发的，现在可以根据确定的细胞表面标志物的表达来检测和选择细胞。事实上，由于剪切力，许多被选择的克隆不能在选择过程中存活下来，因此生长效率很低。此外，为了被检测，需要用荧光染料标记细胞，该荧光染料可能对所选细胞克隆的生长和扩增产生负面影响，并且在体内可能有副作用。

替代性克隆技术：优化单细胞的分离

由于LD方法面临的挑战而对温和流体的需求，推动了新的低压自动铺板方法的发展。铺板设备，如Solentim VIPS® PRO，使用基于图像的细胞检测，在每个孔中滴入单个细胞，并通过在孔中原位成像来立即确认是单个细胞。这样的仪器实现了70-85%的铺板效率，这随着细胞类型的不同而有所差异，但都远远高于LD（30%）。

克隆性确证：整孔成像

由于监管机构要求提供大量详细信息来评估克隆过程，生物技术和制药公司需要提供严格的克隆性证明。因此，他们需要有效的数据，如图像来显示细胞库生成过程中发生的事情。此外，现代成像技术可以监测细胞系的生长，免疫球蛋白等简单分子通常需要14至21天，更复杂的分子则需要28天。Solentim Cell Metric® X 对充满培养基的孔进行整孔高对比度成像，以确认在第0天存在单个细胞，并在随后的整个培养期内进行连续多日成像。

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参考文献

https://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2017/02/2019-FDA-Biopharmaceutical-Approvals-WP-22Jan2020.pdf

https://www.nature.com/articles/d41573-021-00079-7

https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/development-approval-process-cber/2021-biological-license-application-approvals

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28972297/